es细胞培养
原代胚胎成纤维细胞（me）的制备
1.取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死；
2.将鼠腹面向上放置，70%酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；
3.把平皿转入超净台；
4.用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；
5.将鼠胚移入另一新的无菌皿，用pbs洗三次；
6.弃去pbs，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入pbs洗至溶液基本无色（1－4次）；
7.加入适量trypsin-edta（0.25%gibco25520，下同），体积约等于组织块体积；
8.用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；
9.沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。
10.将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；
11.弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（me－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代me制作feeder；若直接使用则不用0代me细胞做feeder，要传到一代以后再用来制作feeder比较好），转入培养箱培养；
12.视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的me细胞均可用来制作feeder。
饲养层细胞（feeder）的制备
注：含10ug/mlc的dmem血清培养基（fbs占10%）（实验室所用mmc为10mg/ml，calbiochem）
1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/mlc的培养基（dmem 10�s）；
2.放入培养箱培养3小时（2－4小时）；
3.用0.1%明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；
4.弃去含有c的培养基，加入2－3mlpbs，轻轻摇动，弃去pbs，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便洗去残存的，是有丝分裂抑制剂，因而对es细胞有毒性）；
5.加入适量消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用es细胞培养基终止消化，然后与es细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；是前一天下午制作feeder，第二天上午使用，这时的feeder状态，es细胞贴壁生长，而且万一制作的feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。
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